花生过敏原检测试剂盒

说明书

产品简介

    花生过敏原检测试剂盒，采用夹心酶联免疫法，用于定量检测食品中的花生或花生碎粒。试剂盒中含有酶联免疫检测所需的所有试剂，包括标准品。
试剂盒足够进行96次检测（包括标准测定）。
定量分析需要使用微孔板酶标仪。
样品处理： 均质和提取
检测时间： 样品制备（以10个样品为例）..............约1小时检测过程（孵育时间）.........................1.5小时
检 测 限： < 2.5 ppm花生，相当于样品中0.00025 % 花生含量
特异性： 多克隆抗体可特异性检测花生蛋白，包括花生过敏原Ara h1和Ara h2。
燕麦、小麦、大麦、芝麻或大豆提取物不会干扰该检测。
与各豆类，如榛果仁、杏仁、核桃、腰果、开心果及山核桃等没有任何交叉反应。
与鹰嘴豆和青碗豆则会产生轻微的交叉反应。
1、用途
   ，采用夹心酶联免疫法，用于定量检测食品中的花生或花生碎粒。花生可以作为成份之一或外部感染物而存在和出现于未经加工的及经加热处理的食品中。
2、概要
   花生营养丰富，常被用作食品或饲料的原料。然而，花生却是zui强过敏性物质。其果粒中高达25 %的蛋白质成分在具营养价值的同时也具有过敏性。其总蛋白含量的7 - 10 %由过敏性蛋白（如花生球蛋白和伴花生球蛋白）组成。强过敏性人员仅摄入毫克级别的花生便可引致过敏反应，症状轻则仅为过敏性皮炎，重则因过敏性休克导致死亡。因为花生过敏是终身性存在的且无法*，所以对此类过敏人员而言，zui重要的便是避免摄入花生。然而对过敏病人而言zui麻烦的便是在经过加工食品中往往隐藏着微量或少量的花生。
   为保护消费者免受花生过敏影响，人们建立了诸如火箭免疫电泳法、快速蛋白液相色谱法及酶联免疫吸附法等检测方法和体系，来检测样品中花生的存在及含量，从而增强产品对花生过敏者的安全性。
3、检测原理
检测的基础是抗原抗体反应。微孔板中包被有针对花生蛋白的特殊抗体。加入标准品或样品，其中含有的花生蛋白和特殊的抗体结合形成抗体抗原复合物。没有结合的部分在洗涤步骤中被除去。随后加入过氧化物酶标记的抗体（酶连接物）。抗体酶连接物和抗体抗原复合物结合，形成抗体-抗原-抗体复合物（“三明治”夹心法）。没有结合的酶连接物在洗涤步骤中被除去。将底物和发色剂加入孔中。酶连接物将发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450 nm 处测量。吸光度值与样品中的花生浓度成正比。
4、试剂盒组份
每一个盒中的试剂足够进行96个试验（包括标准测定），盒中的组份如下：
1 x 96孔微孔板（12条每条8孔） 包被有花生抗体
5 x 标准品（每瓶1.3 ml）* 0 ppm零标准品，3.3 ppm，10 ppm，30 ppm，90 ppm花生提取物水溶液，即用型
1 x 酶连接物（11.5 ml）........................................................................红色瓶盖过氧化物酶标记的抗体，即用型 1 x 底物（7 ml）....................................................................................绿色瓶盖含有过氧化脲 1 x 发色剂（7 ml）.................................................................................蓝色瓶盖含有四甲基对二氨基联苯 1 x 反应终止液（14 ml）........................................................................黄色瓶盖含1 N的硫酸1 x 提取缓冲液（125 ml）......................................................................白色瓶盖 20倍浓缩液1 x 洗涤缓冲液（100 ml）......................................................................棕色瓶盖 10倍缓冲液
*） 已考虑了在样品处理的过程中产生的稀释倍数100。
5、另需的试剂和设备
5.1. 设备：
−微孔板酶标仪（450 nm）
−离心机 + 离心管
−振荡器
−水浴锅
−粉碎机，研钵，Ultra-Turrax匀浆机或者均质器
−刻度移液管
−可调式20 μl - 200 μl 和200 - 1000 μl 微量移液器
5.2. 试剂：
−蒸馏水或去离子水
−脱脂奶粉（食品级）
6、操作者应该注意之事项
反应终止液含1 N硫酸（R36/38， S2-26）。
7、储存条件
保存试剂盒于 2 - 8 °C，不要冷冻。
将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封储存于2 - 8°C条件下。
无色发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
对过了有效期（见试剂盒外标签有效期）的试剂盒不再提供任何质量保证。
不能交叉使用不同批号的盒中试剂。
8、试剂变质的迹象
−发色剂在使用前颜色变蓝
−标准品5的吸光度值小于0.8（E450 nm < 0.8）
9、样品处理
以往分析的花生残留必须去除！样品处理应该在充分清洁或新的玻璃器皿中进行。
同样，粉碎机等设备必须在每次样品处理后进行清洁，去除花生残留。
− 5 g样品小心粉碎，研磨并充分混合
−取其1 g样品，加入20 ml提取缓冲液（参见10.1.，即用型提取缓冲液的温度应为约60 °C）
−充分混合，在60 °C条件下提取10分钟，偶尔振荡。
−离心：10 min / 2500 g / 尽量保持4 °C或过滤提取液（或将2 ml提取液收集于一反应容器中，在微量离心机中高速离心10分钟）
−上清液按比例1:5（1+4）用即用型提取缓冲液（参见10.1.）稀释（例如：100 μl样品和400 μl提取缓冲液混合）
−取100 μl稀释后上清液每孔进行检测
备注：
一般来说，巧克力中花生是可以检出的，但是在多数情况下非常困难（由于花生抗原被遮盖导致回收率下降）。为避免抗原被遮盖，建议在提取过程中加入1 g脱脂奶粉（食品级）。此方法同样适用于冰激凌。巧克力样品在提取前加热融化（35 - 45 °C）并小心混合。
样品提取物在2 - 8 °C条件下可保存5天。不用的提取物在-20 °C条件下可保存数月。
10、检测步骤
10.1. 检测前的准备
使用之前将所有试剂回温至室温（20 - 25 °C）。
提取缓冲液为20倍浓缩液。在稀释前在水浴锅中37 °C条件下充分溶解可能出现的结晶并混合。然后对加热后的浓缩液按比例1:20（1+19）用蒸馏水稀释（例如：100 ml缓冲液浓缩液 + 1900 ml蒸馏水，或者直接加入蒸馏水至2500 ml）。稀释后的提取缓冲液在2 - 8 °C条件下可保存约12周。
洗涤缓冲液为10倍浓缩液，在稀释前如果存在结晶，应在37 °C水浴锅中加热*溶解并混合。然后对加热后的浓缩液按比例1:10（1+9）用蒸馏水稀释（例如：100 ml缓冲液浓缩液 + 900 ml蒸馏水）。稀释后的缓冲液在2 - 8 °C条件下可保存约4周。
10.2. 检测操作
仔细洗板非常重要。避免在操作过程中微孔出现干燥。
1. 将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入微孔板架，记录下标准品和样品的位置。
2. 将100 μl标准品及处理好的样品溶液加到相应的微孔中，在室温条件下（20 - 25 °C）孵育30分钟。
3. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证*除去孔中的液体。每孔加入250 μl洗涤缓冲液（参见10.1.）洗涤微孔。上述操作重复进行两遍。
4. 向每一个微孔中加入100 μl酶连接物溶液，在室温条件下（20 - 25 °C）继续孵育30分钟。
5. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证*除去孔中的液体。每孔加入250 μl洗涤缓冲液（参见10.1.）洗涤微孔。上述操作重复进行两遍。
6. 向每一个微孔中加入50 μl 底物和50 μl发色剂，充分混合后在室温（20 - 25 °C）条件下暗处孵育30 分钟。
7. 向每一个微孔中加入100 μl 反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后30 分钟内于450 nm 处测量吸光度值。
11. 结果评估
使用Cubic spline功能进行结果评估。
花生样品浓度可直接从标准曲线中读出（参见4. *）标准品的浓度值已考虑了稀释倍数100。
以下是没有使用软件的计算方法：
标准品的吸光度值和花生浓度mg/kg（ppm）的相互关系体现在半对数坐标系统曲线图中。每个样品中的花生浓度mg/kg（ppm）可以通过校正曲线上的吸光度值直接读出。
关于标准曲线请参看试剂盒中附带的质保证书。
如果零标准品的E450 nm较高，可认为是未充分洗涤或被污染。
如果样品吸光度值（E450 nm）大于标准品5的吸光度值，应继续稀释后再次检测，以使稀释后的检测结果在标准曲线的可读范围之内。
备注：
此检测中使用的花生提取物中含有约10 %的蛋白质成分。
阴性检测结果并不能说明花生污染浓度低于检测下限，同时样品中还可能含有花生的其他成分如脂类。