大肠杆菌检测试剂盒（荧光PCR法）
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- 产品描述
大肠杆菌检测试剂盒（荧光PCR法）
说 明 书
【产品名称】
通用名称：大肠杆菌检测试剂盒（荧光PCR法）
【货号】
BD-Ⅰ-210
【包装规格】
50Tests/kit
【预期用途】
本品主要用于大肠杆菌检测鉴定及突发公共卫生事件的处置，还可用于大肠杆菌的环境监测、卫生检疫及感染的辅助诊断。仅供研究、不用于临床诊断！
【检测原理】
本试剂盒采用聚合酶链式扩增(PCR)及TaqMan荧光探针技术，对大肠杆菌特异性核酸序列进行扩增并检测，从而判断大肠杆菌的存在。
【试剂盒组成】
序号 | 组分 | 数量 | 规格 |
1 | qPCR Master Mix | 1 | 625μl/管 |
2 | 大肠杆菌反应液 | 1 | 375μl/管 |
3 | 大肠杆菌阳性对照 | 1 | 50μl/管 |
4 | RNase Free H2O(阴性对照) | 1 | 100μl/管 |
【储存条件及有效期】
-20℃避光贮存，避免反复冻融。有效期12个月（请于有效期内使用）。
【适用仪器】
ABI PRISM®7900、ABI PRISM®7500、ABI PRISM®7300、ABI PRISM®7700、ABI PRISM®7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCyclerTM、Qiagen Rotor Gene等。
【样本要求】
样本采集后应及时检测，否则应-20℃保存，避免反复冻融，使用干冰或液氮运输。
【检验方法】
1.试剂准备（试剂准备区）
反应液组份 | 加量 (μl) |
qPCR Master Mix | 12.5 |
大肠杆菌反应液 | 7.5 |
待测标本DNA | 5 |
总体积 | 25 |
2.样本处理（样本处理区）
2.1取200μl的待检样本及阴性对照样本进行核酸提取。DNA可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等微量DNA提取试剂盒提取，按相应说明书要求进行操作。提取好的DNA应及时用于检测，否则应 - 20℃保存。
2.2加样：在准备好试剂的PCR反应管中分别加入阴、阳性质控品、待测样本DNA各5μl，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
3.PCR扩增检测（扩增区）
待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，设定循环参数（请参照各类仪器的操作说明进行设置）。
步骤 | 温度（℃） | 时间 | 循环数（次） | |
1 | 预变性 | 95 | 5分钟 | 1 |
2 | 变性 | 95 | 10秒 | 40 |
退火、延伸及检测荧光 | 58 | 45秒 | ||
步骤2中58℃时荧光检测，检测通道：FAM | ||||
*注：ABI系列荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选择None。
4.结果分析
ABI7500荧光PCR仪:将 baseline设为3-15(根据实际情况，baseline cycler可在一定范围内变化),荧光阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的zui高点，且Ct值=40（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。
5.质量控制
试剂盒中提供阳性质控品、阴性对照各一个，对应Ct值分别为Ct阳、Ct阴；如试剂质量完好并操作正确，Ct阳< Ct阴，Ct阳<30，并呈现典型的S型扩增曲线，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。在每次检测中应设置阴阳性对照品。
6．实验结果的判定
在实验有效的前提下
Ct值≥38 （或undet） | 阴性结果 |
|
35≤Ct值<38 | 检测灰区，应重复测定两次 | 重复测定两次，Ct值≥38，阴性结果；其中1次Ct值<38 ，阳性结果,FAM通道阳性判断为感染大肠杆菌 |
Ct值<35 | 阳性结果,FAM通道阳性判断为感染大肠杆菌 | |
【实验结果的解释】
- 在所有对照都满足要求的前提下，在35个循环之前，所有的临床样本的反应扩增曲线都应该超过阈值线，这表明扩增到足够量的DNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的病毒数量较少而无法出现阳性结果。
- 在38个循环之内，阴性质控品和试剂空白（NTC）荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个的增长曲线超过了阈值线，（1）可能DNA提取试剂污染，在实验前应确保DNA提取试剂无误。（2）DNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。应严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
- 在30个循环之前，阳性质控品应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。
【参考值范围】
1.Ct值≥38（或显示为undet），阴性结果
2.Ct值<35，阳性结果
【检测方法的局限性】
1.样本在收集、处理、运输以及保存不当时，可能出现假阴性或假阳性结果。
2.如果反应中存在抑制物和过量的DNA模板时也可能出现假阴性。
3.实验操作的任何失误都有可能导致无意义的检测结果。
【产品的性能指标】
本试剂盒能检测出相当于103copies/ml的大肠杆菌 DNA；与非大肠杆菌无交叉反应。
【试剂盒使用注意事项】
本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。
为保证实验结果的准确性和可靠性请使用已校准的移液器，选用进口一次性使用的PCR反应管、离心管、tip头等进行样本处理及配液等操作，所有用具应不含DNA酶和RNA酶。
实验应严格分区操作；各区物品,工作服均为,不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台以防污染。
本产品使用前应在室温充分融化，混匀并瞬时低速离心。
标本处理应在生物安全柜中进行，以保护操作人员安全和防止对环境的污染。
每次实验应设置阴阳性对照品。不同批号的试剂请勿混用，在有效期内使用试剂盒。
实验样品尽可能新鲜，提取过程应严防DNA酶污染及操作不当导致的DNA降解。
在-20℃保存的DNA样本，加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时低速离心后使用。
分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。
加样时应使样品*落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免物质泄露污染仪器。
扩增完毕取出反应管，密封在塑料袋内，丢弃于地点。
实验中用过的吸头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
工作台及各种实验用物品经常用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯进行消毒。
实时荧光PCR仪器使用前预热30分钟，连续进行实验时，仪器间隔一小时以上再使用。
实时荧光PCR仪需经常校正和清洁载样板板孔。
本试剂盒涉及的检测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。
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